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PCR到底是什么?

 更新時間:2023-12-29    點擊量:1281

PCR技術(shù)問世已有30多年,期間創(chuàng)新性生物技術(shù)不斷涌現(xiàn),然而PCR技術(shù)的地位依然不可撼動,PCR的全稱是聚合酶鏈式反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction),簡單說來,PCR技術(shù)是利用DNA雙鏈復(fù)制的原理,在生物體外大量擴增特定DNA片段的技術(shù),PCR作為一項bi不可少的技術(shù)手段,仍被廣泛應(yīng)用在基因克隆、基因表達分析、病原體檢測、疾病診斷、基因測序、生物制藥、基因/細胞治療、分子育種、物種鑒定、法醫(yī)鑒定等各個領(lǐng)域。

標準的PCR過程包括三個步驟:變性(Denaturation)——退火(Annealing)——延伸(Extension)。

圖片1.png

一、變性

變性是通過高溫(通常為9095℃)破壞雙鏈DNA的氫鍵,使其變成單鏈DNA。變性的時間和溫度會根據(jù)DNA片段的復(fù)雜程度、GC含量、大小以及緩沖液的鹽濃度來確定。

二、退火

退火是指在DNA形成單鏈之后,通過降低溫度,使引物能夠結(jié)合到單鏈DNA的目標區(qū)域上。一般情況下,引物完成退火所需的孵育時間為0.5-2分鐘。通過計算PCR擴增引物的熔解溫度(Tm),可以確定適當(dāng)?shù)耐嘶饻囟?,通常比引物?/span>Tm3-5℃。

三、延伸

DNA模板--引物結(jié)合物在DNA聚合酶的作用下,以dNTP為反應(yīng)原料,目標序列為模板,按照堿基互補配對與半保留復(fù)制原理,合成一條新的與模板DNA 鏈互補的鏈。

在延伸階段,DNA模板與引物結(jié)合物在DNA聚合酶的作用下,以dNTP為反應(yīng)原料,在模板的指導(dǎo)下,按照堿基互補配對和半保留復(fù)制原理,合成一條新的與模板DNA鏈互補的鏈。一般將溫度設(shè)定在70-75℃之間,因為熱穩(wěn)定性DNA聚合酶在這個溫度下活性最佳。延伸的時間取決于DNA聚合酶的合成速度和目標DNA的長度。當(dāng)目標片段的擴增長度較長(如大于10 kb)時,除了需要增加延伸時間,還需降低溫度,以確保引物能在長時間循環(huán)中保持酶的活性。另外,假如引物退火溫度與延伸溫度相差未超過3℃,則退火和延伸溫度可合并成一步,稱為兩步PCR法,可取代傳統(tǒng)的三步PCR法。兩步PCR法無需在退火和延伸之間轉(zhuǎn)換和穩(wěn)定溫度,從而縮短了PCR所需的時間。通過重復(fù)變性——退火——延伸這三個過程,即可獲得更多的半保留復(fù)制鏈",而這種新鏈又能作為下個循環(huán)的模板,不斷循環(huán)。

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